三种植物精油对肠道主要致病菌生长和颗粒饲料霉变的抑制作用

摘 要：研究三种植物精油及复配植物精油对肠道主要致病菌生长和颗粒饲料霉变的抑制作用。水蒸气蒸馏法提纯植物精油并复配，琼脂打孔扩散法研究单一植物精油和复配植物精油对肠道主要致病菌福氏志贺氏菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌的抑制作用，滤纸片扩散法、破坏性存放试验研究单一植物精油和复配植物精油的防霉作用。结果显示：山苍子精油、肉桂精油和生姜精油组合抑制肠道主要致病菌和霉菌效果最佳( P <0.05)。因此，山苍子精油、肉桂精油和生姜精油配合使用能有效抑制肠道致病菌，添加到颗粒饲料中能有效抑制霉菌，延长保质期。
关键词：植物精油；抑菌活性；肠道致病菌；防霉；饲料
作者：余行、潘洪彬、程燕东、杜津京、周全江、字玲锦、雷清芝、曹振辉

饲料富含蛋白质、淀粉、维生素等营养成分，且结 构疏松、吸湿性强，因此在一定温度、湿度条件下，微生物易繁殖而发生腐败或霉变 [1] 。霉变饲料因霉菌大量繁殖产生霉菌毒素（Mycotoxin），对饲料安全构成极大的威胁 [2] ，霉菌毒素可通过食物链蓄积并威胁人类健康。Park等 [3] 研究表明，霉菌毒素能够通过破坏肠道屏障、增加肠道通透性、诱导肠上皮细胞的炎症反应，严重损害肠道健康，影响动物生产性能的发挥。据联合国粮农组织（FAO）估计，全世界每年有数十亿吨粮食、饲料等农产品受到霉菌污染 [4] ，给饲料工业和畜禽养殖业造成巨大经济损失。目前化学防霉剂主要应用于饲料生产，主要分为三类：有机酸防霉剂、有机酸盐防霉剂和复合防霉剂。其中有机酸防霉剂主要包括苯甲酸、丙酸、乙酸、富马酸等，具有防霉效果好的特点，但腐蚀性较大 [5] 。饲料添加化学防霉剂会影响适口性，且因药物残留、价格昂贵而不被广泛采用，与当今及未来对绿色食品的消费需求不符。因此，研发安全可靠、绿色环保、功能丰富的饲料防霉剂具有良好的应用前景。

植物精油是从芳香类植物或药用植物的根、茎、叶、花或果实中提取的具有挥发性的油状液体，又称挥发油，主要成分含有萜烯类及其衍化物、芳香族化合物和含氮、含硫化物等 [6] 。大部分植物精油都有杀菌、抑菌 [7] 、防霉、驱虫以及抗氧化 [8] 等功能，被应用于食品添加剂、病害防治、杀菌制剂、美容化妆、养生保健等领域。植物精油在动物生产中的相关研究表明，植物精油对猪、鸡、牛等动物具有抗菌、抗病毒、抗氧化、改善动物肠道健康、增强机体免疫力、提高生产性能等作用 [9-10] ，但对饲料防霉效果鲜见报道。

本试验选取了三种植物精油并进行复配，研究其对肠道主要致病菌和霉菌的抑制作用以及在颗粒饲料中的防霉效果，以期为减少常规兽用抗菌药物使用及饲料防霉剂的研发提供依据。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物精油与颗粒饲料
山苍子精油(Litsea cubeba extraction oil, LCEO)、肉桂精油(Cassia oil, CO)、生姜精油(Ginger essentialoil, GEO)，购自吉安市某天然植物有限公司。肉用仔鸡全价配合颗粒饲料，购自昆明某饲料有限公司。日粮组成为：玉米、豆粕、麸皮、石粉、多维、钙磷、氨基酸、微量元素等。日粮营养水平为：粗蛋白≥21%、粗灰分≤7%、粗纤维≤5%、钙 0.8%~1.3%、总磷≥0.6%、氯化钠0.3%~0.8%、水分≤13.8%、蛋氨酸≥0.45%。

1.1.2 主要试剂与仪器设备
试剂：无水硫酸钠、琼脂、蔗糖、无水乙醇、胰蛋白胨等，均由云南省动物营养与饲料重点实验室益生菌资源挖掘与利用课题组提供。培养基：PDA液体培养基（马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1 000 ml，pH值自然）；PDA琼脂培养基(马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 ml，pH值自然)；LB肉汤培养基（胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化钠10 g、蒸馏水1 000 ml、pH值7.2）；LB固体培养基（胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化钠10 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 ml、pH值7.2）。
仪器设备：多段可编程培养箱（PGX-2688，宁波东南仪器有限公司）；电热鼓风干燥箱（CS101-2EB，重庆万达仪器有限公司）；微生物培养箱（DPX-9162，上海福玛实验仪器设备有限公司）。

1.2 试验方法
1.2.1 植物精油复配
试验前采用水蒸气蒸馏法进行植物精油提纯。将提纯后的植物精油4 ℃、5 000 r/min条件下离心5 min后去除无水硫酸钠，取上清液，再用0.22 μm的微孔无菌滤膜过滤到棕色瓶，-20 ℃冰箱保存待用。将离心后的三种植物精油按体积比1??1的比例复配成精油1（山苍子精油+生姜精油）、精油2（山苍子精油+肉桂精油）、精油3（生姜精油+肉桂精油），按1：1：1比例复配成精油4（山苍子精油+生姜精油+肉桂精油）。

1.2.2 肠道主要致病菌抑制试验
采用琼脂打孔扩散法 [11] ，检测不同精油及其组合对4种肠道主要致病菌生长繁殖的抑制作用。4种菌株37 ℃过夜培养后，吸取20 μl菌液与20 ml温度为50 ℃的LB固体培养基剧烈混合后倾注平板。无菌条件下用4个内径为8 mm牛津杯打孔，然后在其中3个孔中加10 μl同种精油作为平行试验组，在第4个孔中加10 μl无菌水作为对照组。37 ℃培养24 h后，测量抑菌圈直径。

1.2.3 霉菌抑制试验
霉菌分离：将自然霉变的20 g饲料样品加入到10 ml灭菌生理盐水中，振荡得孢子悬浮液，吸取1 ml加入PDA液体培养基中，28 ℃培养3 d。采用滤纸片扩散法 [12] ，检测精油对霉菌生长的抑制作用。吸取500 μl、28 ℃过夜培养的霉菌悬液，加入10 ml温度为50 ℃的PDA琼脂培养基中迅速混匀后倾注到已用10 ml、2%的琼脂铺底的平板中，待培养基液凝固后，将精油浸透的圆形滤纸片放在含菌培养基中央，每组做3个重复，用无菌水设置一个空白对照组，放入28 ℃恒温箱培养48 h，待出现抑菌圈后，每天定时测量3组抑菌圈直径，直至其大小不再变化为止。

1.2.4 饲料破坏性存放试验
分别称取肉用仔鸡颗粒饲料1 kg置于无菌托盘中，加入1 ml精油，充分搅拌混匀。参照杜莉等 [13] 的方法进行破坏性存放试验来预测饲料保存期，即将饲料样品保存在较高的温度（25~30 ℃）和湿度（75%~78%）环境中，将饲料轻度霉变的时间乘以6来预测饲料在常规储存条件下的保存期。具体方法为：在1 L的PVC塑料杯子中部放置一个盛有45 ml水的小塑料杯子，将100 g饲料样品均匀放置在大杯子中，饲料高度为小杯子高度的一半，然后将大杯子密封，置于37 ℃恒温箱中培养，每天定时观察菌落生长情况并记录。根据霉菌菌落生长情况来判定饲料发霉等级，共分为没有霉变(表面无霉菌生长)、轻度霉变(表面边缘有少量霉丝生长)、中度霉变(表面有少量散在霉菌)、重度霉变(表面基本长满霉菌)、完全霉变(表面霉菌生长茂密)5个等级 [14] 。根据轻度霉变时间，预测保存期。

1.2.5 数据分析与统计
试验数据用SPSS 18.0软件进行方差分析，均值比较采用Duncan's法。结果用“平均值±标准差”表示， P <0.05表示差异显著。

2 结果与分析
2.1 植物精油肠道主要致病菌的抑制作用
单一植物精油对主要肠道致病菌的抑制作用如表1所示，与对照组相比，三种单一植物精油均对鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌、大肠杆菌K88、大肠杆菌ETEC10有抑制作用。肉桂精油对鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌的抑制作用显著高于山苍子精油（ P <0.05），生姜精油对大肠杆菌K88的抑制作用显著高于肉桂精油和山苍子精油（ P <0.05），肉桂精油对大肠杆菌K88的抑制作用显著高于山苍子精油（ P <0.05）。
复配植物精油对主要肠道致病菌的抑制作用如表2所示，与对照组相比，四种复配精油对鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌、大肠杆菌 K88、大肠杆菌ETEC10均有抑制作用。精油1、3、4组对鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌K88的抑制作用差异不显著，但均显著高于精油2组（ P <0.05）；精油1组对福氏志贺氏菌的抑制作用显著高于精油2、3、4组（ P <0.05），精油3、4组对福氏志贺氏菌的抑制作用差异不显著，但均显著高于精油 2 组（ P <0.05）；精油 4 组对大肠杆菌ETEC10的抑制作用显著高于精油1、2、3组（ P <0.05），精油1组和精油3组对大肠杆菌ETEC10的抑制作用差异不显著，但均显著高于精油2组（ P <0.05）。
2.2 植物精油对霉菌的抑制作用
单一植物精油对霉菌的抑制作用如表3所示，与对照组相比，三种单一植物精油均对霉菌有抑制作用。肉桂精油对霉菌的抑制作用显著高于山苍子精油和生姜精油（ P <0.05），山苍子精油和生姜精油对霉菌的抑制作用差异不显著。
复配植物精油对霉菌的抑制作用如表4所示，与对照组相比，四种复配植物精油均对霉菌有抑制作用。四种复配植物精油对霉菌的抑菌圈大小顺序为：精油2组>精油4组>精油1组>精油3组。

2.3 破坏性存放试验中植物精油对饲料霉变的抑制作用
破坏性存放试验结果如表5所示，在密闭容器中且保持较高的温度和湿度的条件下，空白对照组在第9 d发生霉变，添加山苍子精油、生姜精油的饲料第10 d发生霉变，添加精油1、3的饲料在第11 d 发生霉变，添加肉桂精油的饲料在第12 d 发生霉变，添加精油2、4的饲料在第13 d发生霉变。因此，添加精油2、4可使饲料预测保质期比空白对照组多24 d，比肉桂精油多6 d，比精油1、3多12 d，比精山苍子精油、生姜精油多18 d。
3 讨论
3.1 植物精油对肠道主要致病菌的抑制作用
大肠杆菌、福氏志贺氏菌和鼠伤寒沙门氏菌是常见的动物肠道致病菌，能引起肠道疾病，影响动物健康，目前多使用抗生素防治。但抗生素的使用导致动物肠道菌群紊乱，耐药菌株产生，影响畜产品安全。目前，已经发现的精油超过3 000种，其中具有抗菌活性的有1 340多种，约有300余种已经被开发利用 [15] 。山苍子又称山鸡椒、木姜子、山姜子，樟木科姜子属，其果实、根、叶、花等部位均可用于提取精油，山苍子精油主要是从果实中提取 [16] 。山苍子精油具有抗氧化、抗菌和抗炎作用 [17] 。Nguyen等 [18] 研究山苍子精油对病原菌抗菌活性的结果表明，山苍子精油有较强的杀菌作用，通过改变细胞形态，破坏细胞膜完整性、通透性，改变类核形态抑制大肠杆菌生长。She等 [19] 研究表明从7月份山苍子中提取的精油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、伤寒沙门氏菌均有抑制活性。本研究中，山苍子精油对大肠杆菌ETEC10的抑菌效果与肉桂精油和生姜精油相当（ P >0.05），对鼠伤寒沙门氏菌和福氏志贺氏菌的抑制效果与生姜精油抑菌效果相当（ P >0.05）。肉桂也称中国肉桂，是樟科植物樟属肉桂的干燥树皮，含丰富的挥发油 [20] 。Clemente等 [21]对芥菜和肉桂精油联合抑菌研究，发现两种精油都能穿过细菌细胞膜，通过作用于细胞靶点发挥杀菌作用。Amin等 [22] 采用圆盘扩散法研究不同精油对沙门氏菌的抑制活性，发现肉桂精油和百里香精油抑菌活性最高，抑菌直径为22.5 mm和38.5 mm，这与本试验中肉桂精油对沙门氏菌抑制效果显著( P <0.05)的结果具有相同之处。生姜是姜属植物的新鲜根茎，有百辣辛等名 [23] 。生姜精油是从生姜根茎中提取，呈浅黄或橘黄色，透明且可流动的挥发性成分，具有特殊的香味 [24] 。Hossain等 [25] 研究生姜精油对比目鱼致病菌体外抗菌作用，发现生姜精油对从比目鱼中分离的 Edwardsiel?la tarda 、 Photobacterium damselae 等5株革兰氏阴性菌和 Lactococcus garvieae 、 Streptococcus iniae 、 Strepto?coccus parauberis 等 9 株革兰氏阳性菌均有抑制作用。Kavas等 [26] 研究表明添加1.5%生姜精油可以改善食用包衣的抗菌效果，能减少贮藏过程样品中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌数量。赵露露等 [27] 研究10 种具有较强抑菌作用的植物提取物及其复配物对鸡源致病菌（鸡大肠杆菌和鸡沙门氏菌）的抑制作用，结果表明肉桂精油、苦参碱、绿原酸对鸡源致病菌有抑制作用，两两复配或三种植物提取物复配后对大肠杆菌的抑制作用并未优于单一肉桂精油，本研究中由肉桂精油和山苍子精油复配的精油2组对鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌、大肠杆菌ETEC10和大肠杆菌你K88的抑制效果不如单一的肉桂精油和山苍子精油，其原因可能是肉桂精油与山苍子精油对以上常见肠道致病菌的抑菌机制相同，两者复配没有发挥协同抗菌作用。

3.2 植物精油对霉菌的抑制作用，以及对颗粒饲料保质期的影响
饲料发生腐败或霉变是由微生物大量繁殖引起，霉菌是这类微生物的主体。霉菌毒素是指霉菌在其污染的谷物或饲料中所产生的一类有毒的次级代谢产物，对畜禽养殖业及饲料工业的发展造成严重影响 [28] ，主要有黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素和伏马毒素等。黄曲霉毒素是一类由黄曲霉和寄生曲霉等产毒真菌产生的次级代谢物，包括B1、B2、M1、M2等20种类型，黄曲霉毒素B1毒性最强，有致癌、致畸和致突变等作用，对人和畜禽健康危害极大 [29] 。玉米赤霉烯酮又称F-2毒素，是一种雌激素类霉菌毒素，主要危害动物生殖系统，降低动物的繁殖性能 [30] ，禾谷镰孢菌是其主要产毒菌株。呕吐毒素又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇，是禾谷镰刀菌等粮食病原菌的次级代谢物 [31] ，能引起肠道病变，改变肠道屏障 [32] ，产生免疫毒性 [33] ，危害人和动物的健康。伏马毒素主要由串珠镰刀菌和多育镰刀菌产生的一类有不同多氢醇和丙三羧酸组成的结构类似的双酯水溶性化合物，主要有伏马毒素B1、B2和B3等 [34] ，具有神经毒性、器官毒性、免疫毒性、致癌性等有害作用，严重危害人畜健康 [35] 。有研究表明，霉菌毒素能降低猪的生长性能、免疫功能和繁殖性能 [36] 。饲料的防霉是保障饲料卫生质量安全的重要措施。研究表明天然植物精油能够抑制霉菌生长。Horváth等 [37] 以白色念珠菌、近平滑假丝酵母、烟曲霉菌、土曲霉菌、小孢根霉菌、镰刀菌和伞枝梨头霉为研究对象，研究肉桂精油、香茅精油、丁香精油、薄荷精油和百里香精油抗酵母和抗霉菌活性，结果表明百里香精油、肉桂精油和丁香精油组合抗真菌活性最强。Suhem等 [38] 研究发现氦-氖激光处理的山苍子精油对黄曲霉的抑制活性提高80%，能完全抑制自然放置的糙米生长霉菌至少25 d，没有经精油和激光处理的糙米在 3 d 内观察到霉菌污染。Gómez等 [39] 研究在不同环境条件下，牛至精油和肉桂精油及其主要活性成分香荆芥酚和肉桂醛对玉米提取液中黄曲霉毒素的抑制作用，结果表明精油及其主要成分对真菌生长和黄曲霉毒素产生有抑制作用。邬本成等 [40] 研究肉桂醛和香芹酚等组成的复合植物精油对青霉、黑曲霉和根霉的抑菌作用，并以添加不同水平植物精油（0、100、200、300 mg/kg）饲料发生霉变的时间估计精油在饲料防霉方面的功效，结果表明，植物精油能有效抑制青霉菌和黑霉菌的生长，饲料中添加植物精油不能明显延长其保存时间。本研究结果表明，单一植物精油和复配植物精油均能有效抑制霉菌的生长，极端试验结果显示，植物精油添加到颗粒饲料中能不同程度的延长颗粒饲料的保质期。

4 结论
山苍子精油、肉桂精油和生姜精油等体积复配，能有效抑制主要肠道致病菌、霉菌的生长，按1‰比例添加到颗粒饲料中能延缓发霉时间，延长颗粒饲料的保质期。

参考文献略