栗木水解单宁对产气荚膜梭菌的抑菌作用及对坏死性肠炎肠道损伤的影响

摘 要：栗木水解单宁为栗木中提取的单宁酸，是一种水溶性多酚化合物，具有很强的收敛、抗氧化、高效抑制和杀灭病毒细菌的作用。文章旨在研究通过栗木单宁对产气荚膜梭菌繁殖抑制作用，从而降低由产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎的影响。试验表明，通过体外试验添加栗木单宁对产气荚膜梭菌有明显抑制作用，并且随着添加量的增加，菌株的生长速度和外部直径明显降低和减小。通过添加栗木单宁对坏死性肠炎引起的肠道损伤得到了非常显著的改善。
关键词：栗木水解单宁；产气荚膜梭菌；坏死性肠炎；抑菌试验
作者：刘洋，张亚峰，张宇

随着抗生素在全球范围内的限用，鸡坏死性肠炎的发病率明显升高，造成养殖业巨大经济损失，同时，通过鸡肉制品引起人感染，也给人类食品安全提出严峻的考验。因此开发利用天然物质替代抗生素就成为近年的热点之一。

产气荚膜梭菌( Clostridium perfringens ),又称韦氏梭菌( Clostridium welchii ),是一种梭状芽孢菌属条件性致病菌,在自然界分布非常广,可引起各种动物坏死性肠炎、肠毒血症,同时也是人畜创伤性气性坏疽及人类食物中毒的主要病原菌之一。该菌分为A、B、C、D、E 5个型，通常A型或C型产气荚膜梭菌可引起家禽的坏死性肠炎。

坏死性肠炎是由产气荚膜梭菌引起的一种条件性疾病，临床表现为严重的小肠黏膜坏死，从而导致家禽急性死亡和高死亡率，对全球养禽业造成了巨大损失。研究表明，产气荚膜梭菌正常情况下栖息于畜禽盲肠，不会引起发病，但当肠黏膜受到损伤或肠道菌群发生变化时，它就会在消化道前段大量增殖，从而导致坏死性肠炎的发生。

单宁酸是一种水溶性多酚混合物，分子量在500~3 000之间。尽管几乎所有植物都含有少量的单宁酸, 但根据不同分子量、植物源种类、植物年份、生长地理位置、提取工艺、不同来源，并不是所有单宁酸都可以被动物消化及利用。单宁酸的应用也是多方面的，涵盖了皮革、食品、酿酒和精细化工等，在欧洲通过长期深入的研究发现单宁酸在动物营养领域的良好效果，使其在饲料添加剂方面得到广泛的应用。栗木水解单宁提取的单宁酸有很强的收敛、抗氧化效果，高效抑菌和杀灭病毒作用，有效的抑制许多植物源和动物源病原体，从而提高了动物体的健康水平及食品的安全程度，也得到的良好的投入回报率。

本文旨在探讨栗木水解单宁对于产气荚膜梭菌体外抑制作用的试验验证，并进一步证明栗木水解单宁对动物生长过程中由产气荚膜梭菌造成的坏死性肠炎肠道疾病问题的改善作用。

1 材料和方法
1.1 试验材料
1.1.1 栗木水解单宁
试验用栗木水解单宁产自意大利施华公司，提取来源为意大利北部公司自有的栗木森林，主要成分单宁酸含量75%以上。

1.1.2 指示菌
C型产气荚膜梭菌的菌株A是在随机抽取健康动物的粪便中提取。C型产气荚膜梭菌菌株D来自于随机抽取患有肠道疾病动物的粪便中提取。

1.1.3 培养基
琼脂培养基、庖肉培养基、厌氧蛋白胨水、增菌厌氧汤。

1.2 试验方法
1.2.1 样品采集
粪便样品采集：在试验地区每个鸡场分别随机采集健康和患有肠道疾病鸡的新鲜粪便各20份。共采集新鲜粪便200份。新鲜样品采集后放入样品采集袋中，再将采集袋放入冰盒中带回实验室待检。
动物肠道采集：对15日龄的家禽试验动物饲喂添加0.05%栗木单宁，分别在19日和30日进行安乐死后，并对其解剖检测肠道（小肠、空肠和回肠）的损伤状况。取各部肠道4 cm，纵向剖开，用冰冻生理盐水清洗多次，观察后切成 1 cm 长小段，用锡箔纸包裹迅速放入液氮中，速冻后取出放-70 ℃冻存。

1.2.2 产气荚膜梭菌的分离培养
试验前一晚将产气荚膜梭菌置于疱肉培养基(CMM)培养，使菌株培养在疱肉培养基中37 ℃培养12 h，培养后置于灭菌离心管内于-20 ℃保存备用。

1.2.3 产气荚膜梭菌进行倍比稀释
每次取1 ml菌液进行稀释，使用 10 ml 高压灭菌后的离心管，用灭菌生理盐水进行稀释，每次稀释10倍。

1.2.4 体外抑菌分析
将分离保存的产气荚膜梭菌稀释液（0.1 ml）在疱肉培养基37 ℃培养12 h进行复苏备用。取复苏后的稀释液在添有栗木单宁（0.1 mg/ml）的琼脂板上培养18 h后菌落开始生长并开始计数。

1.2.5 栗木单宁的杀菌分析
栗木单宁对于菌株生长的作用取决于不同的浓度。产气荚膜梭菌经过一晚的培养后，接种0.2 ml到琼脂板培养基。对比分析产气荚膜梭菌A（提取于健康动物）和D（提取于患有肠道疾病动物），在含有栗木单宁溶液的培养基上接种培养。用无栗木单宁溶液的疱肉培养基
作为空白对照，每组两个重复。然后定时对比试验组与对照组的细菌浓度。

1.2.6 栗 木 单 宁 最 小 抑 菌 浓 度（MIC）测定
将栗木单宁进行一系列的稀释处理，在厌氧条件下将产气荚膜梭菌接种到混有不同浓度的栗木单宁的疱肉培养基试管中，在37 ℃中培
养12 h，通过对试管进行肉眼观察，是否变浑浊有细菌生长。通过是否在不同浓度培养基上有细菌生长来判断栗木单宁是否对产气荚膜梭菌有抑制作用，从而根据哪个浓度培养基有细菌生长来判断最小抑菌浓度（MIC）。10个试管中的栗木单宁浓度分别为 0、0.000 5、0.001、0.002、0.003、0.006、0.01、0.05、0.1、0.15 mg/kg。

2 结果与分析
2.1 栗木单宁抑制产气荚膜梭菌的最低浓度(见表1)
通过对比分析，由表1 可知栗木单宁可抑制产气荚膜梭菌 A 和 D 的作用。当栗木单宁的浓度在0.003~0.15 mg/ml 时对产气荚膜梭菌 A 和 D 产生抑制作用。当栗木单宁的浓度在0.01 mg/ml开始对产气荚膜梭菌 A 起抑制作用，当栗木单宁的浓度在0.003 mg/kg开始对产气荚膜梭菌D起抑制作用，产气荚膜梭菌D对于栗木单宁的敏感程度强于产气荚膜梭菌A。
2.2 栗木单宁对于产气荚膜梭菌的抑制作用(见图1)
栗木单宁对于分离自健康动物的产气荚膜梭菌A和分离自患有肠道疾病的动物的产气荚膜梭菌D毒素活性的影响做了对比。随着栗木单宁浓度增加，两种菌株的毒素活性明显降低了。栗木单宁浓度为0.2 mg/ml可有效减少产气荚膜梭菌A50%的毒素活性，浓度为 0.3 mg/ml 时可减少产气荚膜梭菌D50%毒素活性。因此，栗木单宁到达一定浓度时，对产气荚膜梭菌起到有效的抑制作用。
2.3 栗木单宁的杀菌活性(见图2)
栗木单宁在抑制提取自健康动物的产气荚膜梭菌 A 和提取自患有肠道疾病的动物的产气荚膜梭菌D活性方面都表现出了明显的作用。由图2可知，使用栗木单宁杀菌0.5 h后就在产气荚膜梭菌D上面有明显体现，在使用 2~4 h 后杀菌效果体现在产气荚膜梭菌 A 上面。在 5 h 之后，就可以看到在两种菌株上，栗木单宁完全体现了杀菌活性的效果。
2.4 栗木单宁对于坏死性肠炎攻毒状况下的肠道损伤的影响（见图3）
试验发现，对照组小肠、空肠和回肠的损伤评分明显高于试验组。对照组小肠、空肠和回肠的损伤频率也明显高于试验组。所以添加栗木单宁对于因为产气荚膜梭菌造成的坏死性肠炎对于肠道损伤的改善效果非常显著。

2.5 栗木单宁对于坏死性肠炎攻毒状况下肉禽增重的影响(见图4)
试验发现在试验5 d内时，试验组的增重会略低于对照组，但在9 d后慢慢上升直到14 d时试验组的增重明显高于对照组。说明添加栗木单宁对于通过改善因为产气荚膜梭菌造成的坏死性肠炎对于肠道损伤的影响可以明显提升动物的生产性能，增加经济效益。
3 结论
本试验说明栗木单宁对产气荚膜梭菌的生长速率有明显的抑制作用，降低了由产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎对肠道的影响，对提高家禽的增重随时间的增加有显著效果。试验所用栗木水解单宁是一种水溶性天然植物提取物，成分包括水解单宁酸、糖、纤维素、半纤维素及一些有机盐等，具有收敛性，可调控肠道蠕动，提升消化酶的活性和日粮在肠道中的消化利用率，能有效地改善肠道健康，抑制病毒以及有害菌的繁殖，促进动物生长，是很好的抗生素替代产品。